脾臟處理

1.將兩個已解剖分離的脾臟，置于一個15 mL離心管頂部配備的70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)上。使用無菌注射器的柱塞，以溫和力度將脾組織壓碎以通過細(xì)胞篩網(wǎng)進(jìn)行勻漿處理，確保不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在整個過程中，分次使用總計6 -10mL的含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)基，逐步?jīng)_洗篩網(wǎng)以收集細(xì)胞。2.將收集到的細(xì)胞懸液以500 × g離心5分鐘，隨后，小心地去除上清液，并將細(xì)胞沉淀重懸于5 mL的紅細(xì)胞裂解緩沖液中，在室溫下靜置孵育5分鐘。孵育結(jié)束后，迅速加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS）以終止紅裂過程，再次以500 × g離心5分鐘。若沉淀中仍有殘留紅細(xì)胞，需重復(fù)上述裂解和洗滌步驟，直至肉眼所見無紅色。3.細(xì)胞計數(shù)與活力檢測：完成裂解后，以500 × g離心5分鐘，丟棄上清液，然后將細(xì)胞沉淀用1 mL PBS重新懸浮。接下來，采用臺盼藍(lán)排除法鑒別活細(xì)胞，在血細(xì)胞計數(shù)板上進(jìn)行精確的細(xì)胞計數(shù)，以確定活細(xì)胞的數(shù)量。這種方法基于臺盼藍(lán)無法穿透活細(xì)胞膜而能夠染色死細(xì)胞的原理，從而區(qū)分出活細(xì)胞和死細(xì)胞的比例及總數(shù)。4. 通過流式檢測抗體標(biāo)記的脾臟細(xì)胞。尤其需要注意一點(diǎn)，對于脾臟巨噬細(xì)胞的流式檢測，在抗體標(biāo)記前，需要Fc受體的封閉，避免非特異染色。5. 大家拿到自己的流式結(jié)果后，如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符合自己的預(yù)期。這時最需要做的就是質(zhì)控自己的流式數(shù)據(jù)，比如細(xì)胞的分群，大概比例，細(xì)胞的死活，細(xì)胞的數(shù)量，分群是不是集中，一定要找文獻(xiàn)，無論如何，對照組的正常小鼠，這個數(shù)據(jù)是可以參考的。如果自己的流式數(shù)據(jù)對著文獻(xiàn)都不太符合常規(guī)，就不要給給實(shí)驗(yàn)下結(jié)論。這時，基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)體系就有問題。

6. 對于巨噬細(xì)胞，CD11b和F4/80雙標(biāo)，肝臟和脾臟，還有腹腔，肯定會有三群（根據(jù)這兩個maker的表達(dá)高低）。對于很多用荷蘭liposoma品牌的巨噬細(xì)胞清除劑clodronateliposomes氯膦酸二鈉脂質(zhì)體的客戶來說，清除組和對照組，也可以參考這個圖。